Автоматизированная культивирование и дифференциация человеческих эмбриональных стволовых клеток |
Человеческие плурипотентные стволовые клетки (HPSCs), включая эмбриотические СК (hESCs) и индуцированные плурипотентные СК (iPSCs), они могут быть дифференцированы в любой тип клеток человеческого тела, что делает их идеальным инструментом для изучения раннего клеточного развития также как образование тканеспецифичных типов клеток для токсикологических исследований и скрининга. В связи со значительной вариабельностью ручных методов и их огранмиченийи для продукции большого числа клеток, мы считаем, что возможность роста СК и производство большого числа дифференцированных клеток посредством автоматизации признак успеха. Cellular Dynamics International (CDI ) разработала автоматизированные системы культивирования клеток для поддержания и расширения масштабов производства равномерной стартовой популяции hESCs и iPSCs. Она также позволяет проводить высокопроизводительный скрининг малых молекул. Автоматизация hESCs и iPSCs клеточных культур привносит стабильность в процесс скрининга и напрввленной дифференциации hESCs и iPSCs клеток для производства мультипотентных гематопоэтичеких предшественникох клеток HPCs и все другие определенные клоны крови. В частности, мы сосредоточим внимание на поколении мультипотентных (CD43 + / CD34 +) гемопоэтических прекурсоров (HPCS), а также миелоидного предшественника, макрофаги, тучные клетки, мегакариоциты, дендритные клетки и эритроидные клетки. Автоматическая hESC культивирования и поддержания изначально были выполнены на системе Biomek 2000. Система имела технические ограничесния из-за низкой пропускной способности. В результате была приобретена более совершенная система дозирования жидкости Tecan Cellerity. С ее помощью основные трудности в автоматизации процедуры культивирования hESC/iPSC и направленная дифференциация в гематопоэтичнские прекурсорные клетки (HPCs). Автоматическая процедура культивирования для пилотной системы в данный момент осуществляется на станции Cellerity. Текан Cellerity500 оснащена пипетирующим роботом Tecan Freedom EVO200 авотматическим инкубатором Liconic, вместимостью 500 планшет (Storex500), холодильник для хранения среды, автозагрузчик Tecan для предоставления флаконов, счетчик клеток (Cedex), флаконы для работы с суспензионными клетками, работизированная рука для переноса планшет и 8-канальная рука со стальными наконечниками. Cellerity заключена внутрь ламинара II класса биобезопасности. Система работает с клетками в стерильных условиях в специальных флаконах для автоматизации. Площадь флаконов чуть менее 100 см2. Для автоматического доступа дозатора крышка флакона оснащена специальной мембраной. Система дезинфицируется раствором спорицида в конце каждого этапа для предотвращения кросс-контаминации между клеточными линиями. Система использует программное обеспечение CellGEM с интуитивным интерфейсом. С его помощью можно отслеживать каждую клеточную линию производить регулярные пассажи клеток в системе. Система предоставляет полную автоматизацию клеточного роста наряду с планированием текущих задач (смена среды, разделение, сбор клеток и тд.). Новшество (технология) Текан Cellerity 500 предоставляет ключевые компоненты, необходимые для работы с клеточными культурами. Автоматическое разделение колонии hESC/iPSC стало возможным при использовании комбинации ингибитора ROCK (HA-100) и его эффекта на усиление клеточной жизнеспособности. Клетки могут быть дезагрегированы трипсином и пересажены на плашку без центифугирования как отдельная клеточные культуры в присутствии ингибитора трипсина и HA-100 в среде mTeSR. Эта технология исключает необходимость механического оплепления клеток от поверхности планшет; это было разработано CDI . Клетки росли без фидера на матригеле в робофлаконах. Система способна производить 2-3 млрд hESC/iPSC еженедельно. CDI имеет инновационный, бессывороточный, поддающийся автоматизации, протокол прямой дифференциации СК для создания и наращивание HPCS полученной из hESC/iPSC . Процесс представляет собой бессывороточную дифференциацию hESCs на матричных белках (фибронектин, коллаген-4, ламинин) в присутствии цитокинов. HPCS в культуре количественно измеряются согласно соотношению экспрессии CD34+/CD43+. Протокол был оптимизирован для дезагрегированных клеток hESCs в качестве исходного материала. Протокол способен создавать мультипотентные гематопоэтические прогениторы создающие все типы колоний (GEMM: гранулоциты, эритроциты, макрофаги, мегакариоциты; E: эритроид; M: макрофаг; GM: гранулоциты/ макрофаги). Аликвоты гетерогенной популяции HPC помещаются в различные смеси цитокинов для дальнейшей избирательной дифференциации в миелоид (способные образовывать макрофаги и дендритные клетки), мегакариоциты (тромбоциты), или эритроидное поколение (красные кровяные клетки) за дополнительные 2-3 недели в культуре. Протокол дифференциации в дальнейшем может быть оптимизирован с помощью идентификации малых молекул и факторов которые увеличивают выход HPCS. Планируется исследовать новую библиотеку от 10 до 20тыс синтетических малых молекул для завершения этого исследования. Вывод Предоставление индивидуальных плурипотентных СК может служить инструментом для исследования и разработки лекарств, а также в терапии персональной медицины. |